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首页 > 过刊浏览>2024年第43卷第11期 >98-105. DOI:10.12441/spyswjs.20230404002
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金针菇体外CRISPR-Cas9基因编辑系统的建立
CSTR:
作者:
作者单位:

1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510640;2.广东省微生态制剂工程技术研究中心，广东 广州 510640

作者简介:

通讯作者:

郭丽琼（1963—），博士，教授，博士研究生导师，主要从事食药用菌分子生物学与天然产物研究。E-mail：guolq@scau.edu.cn

中图分类号:

基金项目:

国家自然科学基金项目（32072646，32272785）；广东省现代农业产业技术体系创新团队（食用菌）建设项目（2022KJ103，2023KJ103）；广东省重点领域研发计划项目（2022B0202050002）；2022年省级乡村振兴战略专项资金种业振兴项目（2022-WPY-00-006）。


Establishment of an in Vitro CRISPR-Cas9 Genome Editing System for Flammulina filiformis
Author:
Affiliation:

1.College of Food Science, South China Agriculture University, Guangzhou 510640, China;2.Research Center for Micro-Ecological Agent Engineering and Technology of Guangdong Province, Guangzhou 510640, China

Fund Project:

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    摘要:

    金针菇（Flammulina filiformis）具有很高的食用和药用价值。CRISPR-Cas9基因编辑技术近年来得到快速发展，虽然在食药用菌中也有一些成功应用，但其效率偏低。作者以pyrG为目的突变基因，设计并在体外合成gRNA，与蛋白质SpCas9组装成RNP复合物，采用PEG法将RNP复合物转入金针菇原生质体，同时对转化系统参数进行优化。结果表明，软件预测的高分值gRNA不一定有活性，需要在体外与SpCas9组装后对目的基因进行切割鉴定。有活性的RNP复合物转入金针菇原生质体后能够特异性编辑目的基因，而没有活性的RNP复合物转入金针菇后则不能编辑目的基因；在金针菇的转化体系中加入Triton X-100能有效促进RNP复合物进入原生质体。金针菇突变株Sanger测序结果显示，在靶点发生了小片段的插入，说明这些突变株主要是通过非同源末端连接（NHEJ）途径改变基因组信息。作者成功构建了金针菇体外CRISPR-Cas9基因编辑系统，编辑效率为60%。该研究为选育具有优良性状的金针菇新品种及其他食用菌提供理论依据和技术支持。

    Abstract:

    Flammulina filiformis has high nutritional and medicinal value. The CRISPR-Cas9 genome editing technology has been rapidly developed in recent years, with some successful applications in edible and medicinal fungus. However, its editing efficiency is comparatively low. The author targeted the pyrG gene for mutation, designing and synthesizing guide RNA (gRNA) in vitro. The gRNA was assembled with the SpCas9 protein to form ribonucleoprotein (RNP) complexes, which were introduced into the protoplasts of Flammulina filiformis using the PEG method, while the transformation parameters were optimized. The results demonstrated that computationally predicted high-scoring gRNA might not always exhibit activity and needed to be assembled with SpCas9 protein in vitro for cleavage verification of the target gene. Active RNP complexes specifically edited the target gene upon transformation into Flammulina filiformis protoplasts, whereas inactive complexes failed to induce genetic modifications. Adding Triton X-100 to the transformation system significantly enhanced RNP uptake into protoplasts. Sanger sequencing of mutant strains revealed small fragment insertions at the target site, indicating that genome modifications occurred primarily through the non-homologous end joining (NHEJ) pathway. The author successfully established an in vitro CRISPR-Cas9 genome editing technology in Flammulina filiformis, achieving an editing efficiency of 60%. Meanwhile, this study provides a theoretical basis and technical support for the breeding of new varieties of Flammulina filiformis with desirable traits, as well as other edible fungi.

    参考文献
    相似文献
    引证文献
引用本文

杜燕燕,伍土恒,陈柏雄,叶志伟,林俊芳,郭丽琼.金针菇体外CRISPR-Cas9基因编辑系统的建立[J].食品与生物技术学报,2024,43(11):98-105.

DU Yanyan, WU Tuheng, CHEN Baixiong, YE Zhiwei, LIN Junfang, GUO Liqiong. Establishment of an in Vitro CRISPR-Cas9 Genome Editing System for Flammulina filiformis[J]. Journal of Food Science and Biotechnology,2024,43(11):98-105.

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  • 收稿日期:2023-04-04
  • 最后修改日期:2023-06-22
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  • 在线发布日期: 2025-02-21
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