丙酮酸发酵法制备关键技术研究
丙酮酸又称2-氧代丙酸、α-酮基丙酸或乙酰甲酸，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快香味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体，在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。
长期以来工业上生产丙酮酸沿用Howard and Fraser(1932)开发的酒石酸脱水脱羧法。1988，日本东丽工业株式会社(Toray Industries Inc.)的研究人员Miyata Reiko 和Yonehara Tetsu 选育出一系列产丙酮酸Torulopsis 菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1992 年，日本开始采用发酵法生产丙酮酸。
江南大学的陈坚、刘立明教授等在国内外率先进行了丙酮酸的发酵法制备技术开发和应用。CN201310722490.1 公开了一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌及其应用， 其通过异源过量表达抗逆性蛋白CutA,提高了光滑球拟酵母对温度的抗逆性，并提高了基因重组菌株生产丙酮酸过程中最适生产温度。CN201110127826.0 通过敲除酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C)硫胺素合成途径的关键调控基因THI2，干扰硫胺素的合成代谢，进而降低丙酮酸代谢关键酶(丙酮酸脱羧酶)的酶活性，从而减少通向乙醇的碳代谢流，最终促进丙酮酸的积累。该发明公开的酿酒酵母基因工程菌在硫胺素限量添加的条件下，可积累丙酮酸，方法简单，产量可达（6.77±0.14） g/L，为研究代谢工程改造酿酒酵母生产C4 二羧酸奠定了基础。CN201110166742.8 公开了一种利用尿素作为氮源提高发酵法生产丙酮酸产量的方法，其以多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019 为生产菌株，利用尿素代替氯化铵作为唯一氮源，初始添加量为7g/L，在实验室规模7L 发酵罐分批发酵培养。该发明有效提高丙酮酸的产量(11.9%)及生产强度(30.9%)，大幅缩短发酵周期(20.6%)，并在30L 规模发酵罐中成功进行了中试， 具有广阔的工业化应用前景。CN200910034772.6 采用将来源于荚膜胞浆菌(Histoplasma capsulatum)中编码NADH 选择性氧化酶AOX1 基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T.glabrata 中，获得了一株重组菌T.glabrata-AOX，其保藏编号是：CCTCC NO：M 209134。结果表明，构建线粒体内非产能的NADH 氧化途径， 加速NADH 氧化， 能有效提高酵母细胞糖酵解速度及目标代谢产物的生产强度。CN200910184724.5 公开了一种调控培养体系氧化还原电位提高丙酮酸产量的方法， 其通过在光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019 发酵培养基中，控制发酵培养基的溶氧浓度为20%，并在发酵培养基中添加外源电子受体铁氰化钾， 提高培养基的初始氧化还原电位至400 mV， 从而降低光滑球拟酵母CCTCC M202019 胞内NADH 水平，加速糖酵解，提高丙酮酸产量。在此发酵条件下，CCTCC M202019 胞内NADH 质量浓度降低45.3％，丙酮酸产量由49.6 g/L 提高到61.9 g/L。CN200810019988.0 通过改变辅因子NADH 调控碳代谢流加强丙酮酸生产强度，采用分子手段，将来源于乳酸乳球菌(L.lactis)中编码形成水的NADH 氧化酶noxE 基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的工业菌株Torulosis glabrata CCTCCNO：M 202019 中，获得了一株NADH 氧化酶过量表达的重组菌PdnoxE CCTCC NO：M 208022，与出发菌株相比， 菌体干重、葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度分别提高了168% 、44.9%和12% 。CN200810020576.9 利用多重维生素营养缺陷型的光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019 为生产菌株，当发酵过程中丙酮酸钠浓度达到0.4 mol/L 时，向培养基中添加脯氨酸，使培养基中脯氨酸浓度达到1 g/L，脯氨酸作为渗透相容性物质保护光滑球拟酵母细胞，促进CCTCC M202019 合成丙酮酸。丙酮酸发酵周期缩短8h，丙酮酸产量和生产强度分别提高5.4%和18.6%。
丙酮酸发酵法制备技术对实现有机酸发酵工业产业升级和可持续发展、增强我国有机酸生产企业的技术水平和国际竞争力，具有重大的经济和社会意义。（江南大学图书馆张群）
