摘要:通过共表达分子伴侣的策略提高漆酶在毕赤酵母中的产量。前期基于Pichia pastoris密码子偏好性，合成了来源于Cerrena sp. WR1的漆酶基因，克隆至pPIC9K，转化Pichia pastoris GS115，得到重组菌株PP-L。在PP-L中，分别过量表达蛋白质折叠（BIP、ERO1）、囊泡运输（SEC53、SEC1）、胁迫应激（HAC1、GCN4）相关的6种分子伴侣。结果显示，共表达这6种分子伴侣对分泌表达漆酶的菌株PP-L的正常生长没有影响；共表达BIP使重组菌胞外酶活提高359%，共表达ERO1胞外酶活反而降低22%；共表达其它4种分子伴侣对胞外酶活提高18%~53%。组合共表达BIP和HAC1的重组菌P1较PP-L胞外酶活提高了602%，酶活达到3 896 U/L。推测由于强化内质网中BIP水平进而提高了蛋白质折叠能力，从而提高其分泌效率。该研究结果将有助于发酵法生产漆酶的工业化。

摘要:在前期工作中通过分子改造提高了来源于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）α-淀粉酶在高温酸性条件下的稳定性，同时改良了催化效率。为了实现α-淀粉酶在大肠杆菌BL21（DE3）中的胞外高效表达，作者尝试采用共表达嗜热放线菌（Thermobifida fusca）角质酶来增强大肠杆菌膜透性，同时优化诱导策略以提高重组α-淀粉酶的胞外表达。首先构建了能同时表达角质酶和α-淀粉酶的工程菌BL21（DE3）/pETDuet-amy-cutinase，并将此菌株与能单独表达α-淀粉酶的工程菌BL21（DE3）/pET-20b-amy进行摇瓶和3 L发酵罐的产酶发酵对比。结果显示，共表达菌株在胞外产酶方面具有明显的优势。进一步对共表达菌株的诱导条件进行优化，在32 ℃、诱导剂为0.15 μmol/L IPTG与0.5 g/（L·h）乳糖条件下，发酵32 h后胞外α-淀粉酶最高酶活力可达6.05×104 U／mL，是单表达菌株摇瓶发酵水平的28.3倍。此时胞外重组α-淀粉酶质量浓度为8.92 g／L，重组蛋白质的分泌效率为93.2%。

摘要:为了探究灵芝多糖合成途径中磷酸葡萄糖变位酶（α-PGM）的过表达对灵芝多糖发酵产生的影响，利用农杆菌介导法将同源性基因pgm转化灵芝原生质体，筛选灵芝转化子，测定灵芝胞外多糖产量及胞内多糖含量，并研究多糖合成过程中相关酶基因转录水平的相对表达量和酶的活性。结果发现在PGM过表达的重组型灵芝菌株中胞内多糖含量和胞外多糖量最高分别为21.02 mg/100 mg菌体和0.71 g/L，分别比野生型菌株高9.1%和39.2％；灵芝多糖生物合成途径中pgm、pgi基因转录水平表达量较野生型灵芝菌株处于上调状态，且多糖合成代谢中相关酶活性有显著提高。

摘要:酿酒酵母中合成的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（GPI-APs）一半停留在细胞膜上，另一半被转运至细胞壁的β-1，6-葡聚糖上形成GPI锚定细胞壁蛋白（CWPs）。有分析指出，Dfg5和Dcw1是定位于细胞膜的GPI锚定蛋白，可能以同工酶的形式参与GPI-APs转运。但这两个同源蛋白的分子作用机制尚不清楚。为探究Dfg5的作用机制，本研究构建了dfg5?驻PMET3DCW1条件突变菌株。研究发现在DCW1表达抑制型突变株中Cwp1在细胞膜上大量积累。对Dfg5中与甘露糖苷酶催化活性相关保守氨基酸位点分别定点突变，产生的突变蛋白Dfg5^W71A、Dfg5^D122A、Dfg5^D123A无法回补条件突变株的生长缺陷。然而截断Dfg5前导肽的分泌型Dfg5则可回补条件突变株的生长缺陷。上述结果可推测在GPI-APs锚定至细胞壁中，Dfg5至少具有糖苷酶，可将Cwps从细胞膜上的GPI锚中释放出来。

摘要:采用太赫兹波谱技术对工业明胶进行检测，旨在对工业明胶进行定性和定量分析。发现工业明胶在太赫兹波谱下具有明显的特征吸收峰，吸收峰位置为1.55 THz，且在工业明胶比例低至1.57%时，依然有明显的吸收。选择吸收基线值低的修正胶囊样品，混以0%、50%及70%的PE粉作为基质，添加不同比例的工业明胶自制阳性样品。结果显示，PE粉含量越高的样品吸收峰越明显；工业明胶质量分数在5%以上，具有非常明显的吸收。特征吸收峰的峰高与工业明胶质量分数之间存在显著的线性关系，因此太赫兹波谱可以用于工业明胶的定性和定量分析。

摘要:为了实现羟脯氨酸的高产，首先以缺陷型菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BH作为实验菌，通过单因素优化及正交试验，优化得到新的培养基配方及培养条件。其次通过基因工程手段引入透明颤菌血红蛋白VHB基因，构建菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BHV，进行高密度发酵。结果显示，发酵培养基为：麦芽糖10 g/L，甘油5 g/L，胰蛋白胨22 g/L，K₂HPO₄ 4 g/L，FeSO₄（Fe^{2+∶VC=1∶1） 5 mmol/L，MgSO₄·7H2O 1.7 g/L，NaCl 3 g/L，CaC l ₂ 0.005 g/L；培养条件为：初始pH 8.5，温度30 ℃，接种体积分数4%，转速220 r/min。此条件下，菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BH羟脯氨酸产量约为1 602 mg/L，约为优化前的1.4倍. 在7 L罐发酵培养，菌株E. coli JM109ΔargB/pUC19-BHV的羟脯氨酸产量约为18.3 g/L，与JM109ΔargB/pUC19-BH相比，提高了13.2%，说明VHB 基因的引入有利于羟脯氨酸产量提高.}

摘要:糖苷水解酶85家族的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶具有糖基转移酶活性，利用该类酶，可以合成特定结构N-糖链修饰的糖基化复合物。为构建糖基转移酶筛选系统，将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的跨膜定位区域与绿色荧光蛋白融合表达，成功把带有天冬酰胺连接糖基化位点的单体增强绿色荧光蛋白定位到中国仓鼠卵巢细胞的高尔基体中。流式细胞仪分析显示，融合了定位区域后，绿色荧光蛋白仍可以发出荧光，且在引入糖基化位点后，细胞荧光强度约降低10倍。经衣霉素处理，细胞糖基化被抑制，同时荧光强度减弱。此细胞株荧光强度对于糖基化水平的依赖性表明其在糖基转移酶的进化筛选方面的应用潜力。

摘要:探讨滇结香花正己烷提取物组分1（Fr.1）改善棕榈酸（Palmitic acid，PA）诱导C2C12肌细胞产生胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）的效果及其作用机制。方法：本文采用PA诱导C2C12肌细胞建立稳定的胰岛素抵抗细胞模型，通过检测Fr.1对胰岛素抵抗细胞（C2C12/IR）葡萄糖消耗量、葡萄糖摄取量的变化，研究其对PA介导的AMP活化蛋白激酶（AMPK）、胞内磷脂酰肌醇激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信号通路中相关基因及蛋白表达的影响。结果：0.75 mmol/L PA作用C2C12肌细胞16 h作为最佳建模条件；Fr.1在无细胞毒性范围内（12.5~100 μg/mL）可显著增加C2C12/IR对葡萄糖的消耗量及摄取量；Fr.1可明显上调胰岛素受体（Insulin receptors，IRs）、胰岛素受体底物（Insulin receptor substrate-1，IRS-1）、葡萄糖转运蛋白4（Glut4）、PI3K、AMPKα基因的表达水平，并上调p-IRs、p-IRS-1、Glut4、p-AMPKα、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（p-ACC）、p-AKT蛋白质的表达水平，表明滇结香花提取物Fr.1可通过调控多个信号通路改善IR。

摘要:罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是一种安全、高效生产罗伊氏细菌素的菌株。作者优化了罗伊氏乳杆菌ATCC 53608转化甘油生产罗伊氏细菌素的工艺参数。结果表明：处于初期稳定期（26 h）的L. reuteri，其细胞内甘油脱水酶能达到最大酶活2.2 U/mg，有利于转化甘油生产罗伊氏细菌素。正交实验优化后的最佳生产工艺：甘油浓度400 mmol/L，接种量110 mg/mL，酶转化时间2 h，转化温度30 ℃，pH 6.2。优化后罗伊氏细菌素的平均产量达到（241.2±3.4） mmol/L。

摘要:不同的杂交瘤细胞株，分泌的抗黄曲霉毒素单克隆抗体的灵敏度也大不相同，通过筛选获得三株杂交瘤细胞，分别命名为2C10、2E6和2H1，其中2C10分泌的单克隆抗体在酶联免疫吸附（ELISA）试验中具有最高的灵敏度，2E6次之，2H1再次之。为了能够更好的展现和理解抗体和抗原之间的反应关系，以及最大程度的提高重组抗体的灵敏度，实验通过构建3株细胞株的单链抗体，并在E. coli BL21（DE3）中表达纯化单链抗体蛋白质，采用竞争ELISA法展现了不同的单克隆抗体与所对应的单链抗体灵敏度之间的关系。结果表明，灵敏度最好的单克隆抗体2C10所对应的单链抗体，其灵敏度也是最好的，2E6的次之，2H1的再次之。同时实验也表明，人工合成的单链抗体的灵敏度较其所对应的单克隆抗体的灵敏度要下降许多

摘要:针对胶质芽孢杆菌SM-01发酵液粘度高，菌液分离困难而导致胞外多糖提取效率低的问题，采用硅藻土吸附-抽滤法，对提取工艺及超滤条件进行了研究，确定了工艺参数。结果表明，发酵液中NaCl添加量为3 g/dL，发酵液稀释倍数为3倍，硅藻土添加量为10 g/L时，在室温下抽滤可除去菌体和蛋白质。滤液在0.1 MPa下经截留相对分子质量为200 000的超滤膜超滤纯化，多糖回收率可达73.2%。

摘要:酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）二倍体细胞在缺乏氮源且存在非发酵型碳源时，营养细胞停止生长，进入产孢过程并通过减数分裂形成单倍体孢子。产孢过程并不存在于哺乳动物细胞中，但该过程中发生的很多细胞活动在真核细胞中存在保守性。作者建立了一个筛选特异性抑制酿酒酵母产孢的人类基因的方法。在酿酒酵母中表达单独的人类基因，筛选得到抑制产孢过程但对酿酒酵母营养细胞生长不产生影响的候选人类基因。获得的候选基因很大可能涉及营养敏感性、减数分裂以及膜运输重组这些产孢过程中发生的细胞活动。本研究对新功能人类基因的发现以及将酿酒酵母作为遗传研究工具有着重要的意义。

摘要:肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）在治疗肝纤维化过程中扮演着重要角色，但其在血液循环中并不稳定，半衰期短，提高HGF在血液循环中的稳定性是HGF应用性研究的重要内容。作者在课题组前期研究的基础上，对人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）融合蛋白HSA-HGF的体内抗肝纤维化能力进行了研究。通过 CCl₄ 诱导构建小鼠肝纤维化模型，并设置（1）正常组、（2）模型组、（3）阳性组、（4）HSA组、（5）HGF治疗组、（6）HSA-HGF治疗组。经过苏木素-伊红染色、Masson染色、血清肝功能指标活性检测、qRT-PCR法检测肝组织中α-SMA和COLⅠ基因转录水平、TRFIA法检测体内半衰期，从而鉴定各组抗肝纤维化效果。结果显示：1）运用 CCl₄构建肝脏损伤小鼠模型，药物作用后结果显示融合蛋白HSA-HGF及其单体药物均可以明显地促进小鼠的肝脏恢复；2）与单体药物相比，融合蛋白HSA-HGF在降低给药频率的情况下能取得相当的治疗效果；3）小鼠体内半衰期分析显示，融合蛋白的体内半衰期由单体的3 min增加到3 h左右。表明融合蛋白HSA-HGF具有明显的抗纤维化效果，与单体药物相比，融合蛋白药物的半衰期明显延长，表明该融合蛋白稳定性更佳，具有成为抗肝纤维化药物的潜力。

摘要:为提高裂殖壶菌产DHA的生产强度，筛选比较出对裂殖壶菌生长和产油有显著影响的促进因子，发现 Fe²⁺对Schizochytruim sp.AB-610生长有显著的促进作用，吲哚丁酸（IBA）对裂殖壶菌生长和产油有双重促进作用。在此基础上进行了两因素（Fe2+和IBA）、三水平响应面实验，通过响应模型得到最优添加方案。在摇瓶发酵中得到验证后，继而在NBS 7.5 L发酵罐内测定对照组Schizochytruim sp.AB-610的发酵特性曲线，依据其发酵规律，将发酵周期分为菌体适应期、快速生长期、油脂快速积累期、油脂返耗期。测定了Fe2+和IBA对7.5 L发酵罐中裂殖壶菌培养和发酵的特征曲线，并与对照组进行多参数比对，发现添加双促进因子可加大快速生长期的细胞生长速率，延长生物量增长的时间，生物量和DHA产量皆得到提高。最终使Schizochytruim sp.的DHA生产强度提高了51.22%。

摘要:IFT57是纤毛内运送蛋白IFT B复合物的一个重要组分，在鞭毛组装中发挥着重要作用。利用莱茵衣藻ift57基因中一段编码亲水性氨基酸序列的片段构建了带有6×His标签的原核表达载体pET-28a（+）-ift57，并转入大肠杆菌BL21（DE3），通过IPTG诱导表达蛋白质，以12 g/dL SDS-PAGE鉴定，获得相对分子质量大小为17 200的ITF57重组蛋白质片段。对6×His-IFT57融合蛋白质进行纯化，并用其免疫新西兰大白兔，采集第5次免疫后血液并分离血清。利用Western blotting对所获抗体进行特异性鉴定。ELISA测定结果表明，抗血清效价为512 000。在抗血清经Protein A纯化后，Western blotting检测显示所制备的IFT57多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻中的IFT57蛋白质。这一结果表明，为表达纯化溶解性较差的蛋白质抗体制备提供了借鉴意义，所获抗体为深入研究IFT57在鞭毛组装中的作用机理奠定了基础。

摘要:为了提高乳酸菌在喷雾干燥过程中的可培养性，以德氏乳杆菌ATx为研究对象，在分析不同热胁迫条件对其细胞可培养性的影响的基础上，以20 g/dL脱脂乳（SM）、12 g/dL脱脂乳+8 g/dL菊糖（SMS）、12 g/dL脱脂乳+8 g/dL海藻糖（SMT）、12 g/dL脱脂乳+4 g/dL菊糖+4 g/dL海藻糖（SMST）为保护剂，探讨了喷雾干燥对菌体己糖激酶、乳酸脱氢酶、细胞膜ATP酶、细胞可培养性以及产酸性能的影响。结果表明：德氏乳杆菌ATx的最佳热胁迫条件为（50 ℃，15 min），此时细胞活菌数仅下降0.107 lg CFU/mL（P≥0.05）。经过喷雾干燥后菌体的细胞膜ATP酶、已糖激酶与乳酸脱氢酶的活性均显著地降低（P<0.05），但均高于对照组。四种菌粉在12 g/dL脱脂乳中的产酸性能良好，凝乳时间为8~10 h，说明喷雾干燥会对德氏乳杆菌ATx的细胞膜与糖代谢关键酶造成损伤，通过添加保护剂可以提高细胞对喷雾干燥中不利环境的抵抗力，从而提高可培养性。

摘要:为了建立ε-聚赖氨酸（ε-PL）分离提取过程中的纳滤脱盐方法，作者在纳滤膜种类筛选基础上，以模拟料液为研究对象，通过单因素实验优化了纳滤膜脱盐条件，并将其应用到离子交换洗脱液的脱盐中。研究结果表明，纳滤膜SP800在透过通量、ε-PL收率和脱盐率等指标上均最优，适合用于ε-PL脱盐；纳滤膜SP800脱盐条件为：料液pH值为9.0，最大浓缩倍数对应ε-PL质量浓度为100 g/L左右，再加入去离子水以恒容渗滤方式脱盐，直到透过液电导率低于300 μS/cm为止。该脱盐工艺处理1 000 L ε-PL离子交换洗脱液时，脱盐率达到96.43%，ε-PL损失率0.77%；ε-PL纯度达到98.21%，灰分为1.02%。本研究是首次尝试纳滤用于ε-PL分离和提取过程脱盐，对ε-PL产业化生产具有一定的指导意义。

摘要:咸鸭蛋蛋清盐含量高制约着其发展，探索利用微生物处理脱盐以及其特性研究有利于提高其综合利用程度。从金华火腿中筛选出优质的耐盐菌Staphylococcus equorum，接种发酵48 h，微生物生长过程中分泌的蛋白酶破坏蛋清蛋白结构，降低体系黏度，释放出结合水带走大量的盐分；取沉淀加水复溶，通过不同截留相对分子质量的超滤膜分离得到各个组分。结果表明，样品离心后沉淀物中的盐质量分数降低至3%左右，发酵产物的自由基清除能力、还原力、Fe2+螯合能力、抑制脂质过氧化能力等抗氧化活性随相对分子质量降低而增大，相对分子质量小于3 000的产物表现出极强的抗氧化活性。

摘要:对褶皱假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL）固定化进行研究，采用吸附法将CRL固定在4种不同树脂上，采用考马斯亮蓝法测定酶蛋白在树脂上的固定化率，GC测定催化合成丁酸香叶酯的酯化率，筛选出固定化效果最好的弱酸性大孔阳离子交换树脂D151。采用单因素实验考察酶液浓度、磷酸盐缓冲液pH值以及固定化温度对固定化效果的影响，以固定化酶催化合成丁酸香叶酯的酯化率为指标，优化固定化过程。结果表明，CRL经树脂D151固定后，在酶液质量浓度15 mg/mL，磷酸盐缓冲液pH 6.5，固定化温度45 ℃条件下，吸附8 h，固定化酶具有最高的催化性能，丁酸香叶酯的酯化率可达84%。

摘要:为探讨海藻铁钉菜提取物的抗氧化、抗酪氨酸酶活性与降糖作用，作者采用DPPH、羟基自由基清除体系测定铁钉菜水提醇沉上清液部分（SWEAPI）的抗氧化活性，采用多巴色素法测定其抗酪氨酸酶活性，并以可溶性淀粉、甜蜜素、β-环状糊精为辅料，采用正交实验设计的优化条件制备铁钉菜固体冲剂；通过体外α-葡萄糖苷酶活性抑制实验与体内四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型，研究该冲剂的降血糖作用。结果表明：SWEAPI具有较强的自由基清除能力与抗酪氨酸酶活性，其DPPH自由基清除的半效应质量浓度EC ₅₀ 为1.19 mg/mL，羟基自由基清除的EC ₅₀ 为5.08 mg/mL，酪氨酸酶活性抑制的半效应质量浓度IC ₅₀ 为1.27 mg/mL；这可能与其较高的多酚含量（8.30%）有关。采用SWEAPI：可溶性淀粉：甜蜜素：β-环状糊精为30∶60∶1∶7.5的配比进行铁钉菜冲剂制备可获得较好的产品质量，冲剂的水分质量分数≤10%、总糖质量分数约为18.74 %、蛋白质质量分数16.60%、多酚质量分数2.53%。该冲剂具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，半效应质量浓度IC50为0.37 mg/mL。口服冲剂14 d后，与模型组比较，350 mg/kg的使用剂量时可极显着降低糖尿病小鼠血糖，糖耐量实验进一步证实其可以在短时间内降低餐后血糖，总体上，其降糖效果与阳性药物二甲双胍处理组（500 mg/kg）相近。可见，SWEAPI具有较强的抗氧化活性、抗酪氨酸酶活性与降糖作用，具有开发成海藻源护肤品、降糖功能产品的潜在应用价值。

摘要:乳化剂能降低各相间的表面张力，使互不相溶的成分相互混合形成乳化现象并保持稳定。鱼丸富含蛋白质、脂肪、水等成分，稳定性较差，借助乳化剂可以增强其乳化效果，降低低温对其品质的影响。作者以草鱼鱼丸为研究对象，比较五种乳化剂在不同添加量下对鱼丸品质的影响以及冻藏前后的变化。通过对鱼丸样品的冰温曲线、水分质量分数、凝胶强度、盐溶蛋白质量浓度和酪氨酸质量浓度测定，确定冻融稳定性最好的乳化剂为蔗糖脂肪酸酯。实验结果表明：质量分数0.8%的蔗糖脂肪酸酯为最佳添加量，可以很好地锁住鱼丸水分，增加凝胶强度，增强抗冻性能，使鱼丸口感达到最好。