• 2022年第41卷第10期文章目次
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    • 浓香型白酒风味乙酯微生物合成机制研究进展

      2022, 41(10):1-16. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.001

      摘要 (78) HTML (0) PDF 4.38 M (187) 评论 (0) 收藏

      摘要:浓香型白酒是中国传统特色蒸馏白酒的典型代表,具有悠久的历史,风味独特。风味分析表明脂肪酸乙酯对浓香型白酒的感官具有重要影响。白酒发酵过程微生物所产酯合成酶催化酸和乙醇的酯化反应是脂肪酸乙酯的重要合成途径,然而目前相关的酶催化机制尚不明晰,导致浓香型白酒发酵过程酯类风味物质合成不稳定,是制约产业发展的瓶颈问题之一。经典的酶催化酸醇酯化反应存在于有机相体系,而白酒发酵过程中酒醅含水量(质量分数)为53%~58%,属于水相体系,发掘和解析水相体系脂肪酸乙酯合成酶及其催化机制可以促进浓香型白酒的品质改善。作者对浓香型白酒酯类风味物质及微生物代谢研究进展进行总结,并深入探讨酯合成酶的结构和催化机制,为明晰浓香型白酒脂肪酸乙酯的合成机制提供科学依据。

    • 卡拉胶多糖的分子修饰:卡拉胶酶和硫酸化酶的研究进展

      2022, 41(10):17-36. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.002

      摘要 (63) HTML (0) PDF 6.38 M (158) 评论 (0) 收藏

      摘要:卡拉胶(carrageenan)是一种从海洋红藻细胞壁中提取出来的多糖物质,通过1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D -吡喃半乳糖交替连接作为基本骨架形成的线性硫酸多糖。研究表明,卡拉胶及其分子修饰后获得的衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、增强人体细胞免疫和体液免疫力等多方面生物活性。卡拉胶酶属于糖苷水解酶,通过使β-1,4糖苷键断裂来降解卡拉胶。卡拉胶硫酸酯酶又被称作卡拉胶硫酸化酶,是一种作用于卡拉胶寡糖的硫酸基使之游离出无机硫酸的酶。经研究证实,这两种酶对于卡拉胶多糖的降解具有协同作用。然而由于卡拉胶多糖结构的复杂性,人们对于卡拉胶的降解及分子修饰大多数尚未探索。现如今,随着技术的进步以及卡拉胶多糖生物活性的多样性,卡拉胶多糖的分子修饰引起了相关研究者的持续关注。作者概括了近年来卡拉胶多糖的分子修饰,重点介绍了卡拉胶酶和硫酸化酶的研究进展,进一步阐述了其修饰后的生理活性变化。

    • 蔗糖合成结构可控的功能性淀粉研究进展

      2022, 41(10):37-48. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.003

      摘要 (36) HTML (0) PDF 4.01 M (132) 评论 (0) 收藏

      摘要:功能性淀粉的开发和应用是食品和医药工业的研究热点之一,越来越受到消费者的青睐。酶法合成是获得功能性淀粉的有效途径,因其具有绿色环保、安全健康等特点受到多个领域学者的广泛关注。作者概述了蔗糖人工合成直链淀粉和高支化淀粉的结构调控原理,总结了淀粉蔗糖酶和糖原分支酶在功能性淀粉结构合成中的研究进展,阐述了直链淀粉和高支化淀粉在功能食品和医药领域中研究动态及应用前景,为功能性淀粉的进一步开发提供借鉴和参考。

    • 米曲霉β -半乳糖苷酶的定向进化、高效表达及应用

      2022, 41(10):49-57. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.004

      摘要 (45) HTML (0) PDF 3.18 M (105) 评论 (0) 收藏

      摘要:定向进化米曲霉β-半乳糖苷酶(AoBgal35A),以提高其水解乳糖的效率,通过易错PCR构建米曲霉β-半乳糖苷酶的突变体文库,高通量筛选水解乳糖效率高的突变体,将其在毕赤酵母中高效表达,并用于制备无乳糖牛奶。筛选得到一个正向突变体(mAoBgal35A),经高密度发酵酶活力达4 760 U/mL。纯化后,mAoBgal35A的最适pH和温度分别为5.0和55 ℃,比野生型AoBgal35A分别提高了0.5和降低了5 ℃。mAoBgal35A在室温下能高效水解牛奶中的乳糖,加酶量为2 U/mL时,水解72 h后牛奶中的乳糖质量浓度为0.38 g/dL,达到无乳糖牛奶标准。而野生型AoBgal35A的加酶量为20 U/mL时,在相同条件下水解后,乳糖质量浓度为0.6 g/dL。由此表明,定向进化明显提高了米曲霉β-半乳糖苷酶水解乳糖的效率,所得正向突变体在制备无乳糖乳品中具有很大的应用潜力。

    • 谷氨酸脱羧酶基因的挖掘、表征及全细胞制备γ-氨基丁酸的研究

      2022, 41(10):58-66. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.005

      摘要 (51) HTML (0) PDF 2.74 M (103) 评论 (0) 收藏

      摘要:γ-氨基丁酸是一种重要的生物活性因子,通过谷氨酸脱羧酶(GAD)使L-谷氨酸脱羧而合成。作者首先将酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因进行克隆并实现其在大肠杆菌中表达。通过亲和层析纯化获得了比活力高达66.55 U/mg的重组酶ScGAD。进一步酶学性质分析结果表明,ScGAD最适反应温度为60 ℃,最适反应pH 为4.0,且在30~50 ℃、pH 4.0~9.0时表现出优越的稳定性;其动力学参数Km为14.28 mmol/L,对L-谷氨酸具有较好的亲和力。最后通过全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA)的最适条件探究,得到GABA生成效率最高的条件为60 ℃、pH 4.0,在此条件下,100 mmol/L底物L-谷氨酸经全细胞催化可合成GABA 35.9 g/(g·h)。该研究为GABA高效生产提供依据。

    • C端柔性区域对多糖降解菌来源的麦芽五糖生成酶冷适性的调控

      2022, 41(10):67-76. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.006

      摘要 (40) HTML (0) PDF 3.55 M (83) 评论 (0) 收藏

      摘要:冷适麦芽五糖生成酶在低温下具有较高的催化活力,同时能够在室温下快速水解淀粉并特异性地生成具有营养功效的麦芽五糖,因此在食品、医药等领域具有广阔的应用前景。作者以来源于Saccharophagus degradans的两种麦芽五糖生成酶(SdG5A和SdG5A-CD)为研究对象,将其分别表达于Bacillus subtilis中,并分析比较了重组酶的冷适性。结果表明,重组SdG5A在0 ℃下可以保持27.8%的酶活力,在室温下生产麦芽五糖的得率高达48.6%,具有较强的冷适性;而不含有linker和淀粉结合域(SBD)的SdG5A-CD不具有冷适性。为了探究SdG5A的冷适性机理,利用RoseTTAFold构建了结构模型,并利用分子动力学模拟等方法分析了结构柔性。结果表明,位于SdG5A C端的linker-SBD区域具有极高的柔性,且在0 ℃下的均方根涨落与45 ℃保持一致,说明linker-SBD结构高柔性的分子特征是影响SdG5A冷适性的关键因素。

    • ZIF-8@纤维素酶-细胞共固定化体系的构建及强化丁酸合成的应用

      2022, 41(10):77-86. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.007

      摘要 (58) HTML (0) PDF 3.04 M (103) 评论 (0) 收藏

      摘要:酶-细胞共固定化作为多酶固定化策略的拓展,因其能分层包埋固定化酶和细胞不同生物分子从而强化系统催化性能,成为现阶段酶工程研究的新热点。为了将这一新技术用来强化丁酸的合成,作者基于仿生矿化法构建沸石咪唑酯骨架(zinc zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)分隔包覆纤维素酶和酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum,Ct),制备ZIF-8@纤维素酶-Ct共固定化体系。通过SEM、FT-IR、XRD等技术表征以及进行酶解、发酵实验的分析验证,该体系具有更优的同步糖化发酵性能。结果表明:在最适条件(40 ℃、pH 4.5)下,底物玉米芯水解率达56.02%,葡萄糖转化率为85.61%;进一步置于不同的pH和氧气体积分数下,发现有ZIF-8@纤维素酶包覆的细胞具有更高、更稳定的比生长率和相对细胞活力以及较低的相对活性氧水平,丁酸在32 h内产量达到6.74 g/L,比未固定化细胞提高了12.52%。

    • N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的异源表达及甘油糖苷的酶法合成

      2022, 41(10):87-95. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.008

      摘要 (43) HTML (0) PDF 4.79 M (129) 评论 (0) 收藏

      摘要:从杆菌状链霉菌中克隆了一个N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-glucosaminidase,NAGase)的编码基因sbnag2550,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。利用镍离子亲和层析得到纯酶后对SbNag2550的酶学性质进行了研究。该酶的最适温度为50 ℃,在45~60 ℃均表现出90%以上的酶活力。SbNag2550还表现出优良的热稳定性,在55 ℃孵育60 h仍能保留将近90%的酶活力。利用SbNag2550催化N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-glucosamine,NAG)和甘油发生逆水解反应,合成了甘油-N-乙酰氨基葡萄糖苷(glyceryl N-acetyl-glucosamine,GNAG)。在最适条件下,反应24 h时转化率达到28.20%,反应72 h时转化率为34.82%。本研究中首次通过酶法合成了GNAG,为其功能研究和应用开发奠定了基础。

    • 山梨醇对黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶(r-Rha1)热稳定性的影响

      2022, 41(10):96-103. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.009

      摘要 (80) HTML (0) PDF 2.57 M (130) 评论 (0) 收藏

      摘要:提高酶热稳定性是工业酶属性改造的重要目标。山梨醇作为广泛应用于提高酶稳定性的外源添加剂,目前对其影响酶热稳定性的机制仍不明确。因此,作者以黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶(r-Rha1)为研究对象,通过热失活动力学、圆二色谱和荧光光谱的谱学分析,研究山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性的影响机制。结果表明,在60~70 ℃下,加入山梨醇可改善α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性;在60、65、70 ℃条件下,加入1.2 mol/L山梨醇可分别将半衰期提高29、25、10倍;圆二色谱和荧光光谱结果表明山梨醇通过增强α-L-鼠李糖苷酶的表面疏水活性和结构刚性,从而提高其热稳定性。通过探究山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性的影响,进一步证明山梨醇提高酶热稳定性的普遍适用性,同时为后续α-L-鼠李糖苷酶的工业应用提供了参考。

    • 分子伴侣共表达对重组蔗糖异构酶异源可溶性表达的影响

      2022, 41(10):104-112. DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2022.10.010

      摘要 (40) HTML (0) PDF 3.34 M (97) 评论 (0) 收藏

      摘要:蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SIase)在异麦芽酮糖的酶法制备中发挥着重要作用。为了提高重组蔗糖异构酶的可溶性表达,作者利用分子伴侣共表达策略将源自Klebsiella sp. LX3的基因SIase进行异源表达并研究了重组酶的酶学性质。利用酶切连接技术构建重组质粒pET-24b-SIase并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达,发现其主要表达为包涵体。分别将携带4种分子伴侣蛋白基因的质粒(pKJE7、pGro7、pG-Tf2、pTf16)与含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中共表达,筛选到最佳分子伴侣质粒pGro7且提高了重组SIase的可溶性表达水平,其酶活力为14.8 U/mL,比未进行共表达的工程菌发酵酶活力(3.5 U/mL)有明显提高,进一步利用金属离子螯合层析技术纯化到SIase纯酶,酶学性质研究显示其最适反应温度为40 ℃,最适反应pH为6.0。动力学常数Km为(179.10±20.65) mmol/L、kcat/Km为(5.44±0.72) L/(mmol·s)。产物特异性研究结果显示,随反应温度的提高,产物中异麦芽酮糖和海藻酮糖比例下降,单糖比例提高。利用分子伴侣共表达策略能够提高重组SIase的可溶性表达水平,促进SIase的规模化制备和应用。

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